Los análisis completos del genoma mitocondrial confirman que el murciélago Polychromophilus y los ungulados forman un clado distinto e independiente de otras especies de Plasmodium

Muestras de sangre, extracción de ADN, amplificación y secuenciación del genoma mitocondrial.

Siguiendo los procedimientos establecidos, se recolectaron muestras de sangre de murciélagos de sitios de muestreo seleccionados en Kanchanaburi, ubicado en el oeste de Tailandia, durante 2019 y 2021.^23,33,34. Para este estudio, cuatro muestras de murciélagos (2 Myotis siligoensis Y 2 Hyposiderus gentilis) ha sido explotado. Estas muestras habían dado positivo previamente. policromophilus Parásitos que utilizan cebadores oligonucleotídicos identificados en un estudio anterior²³. En la Figura S1 se muestran imágenes de frotis de sangre derivados de estas muestras. El ADN genómico se extrajo de muestras de sangre completa combinadas utilizando el kit de sangre NucleoSpin (Macherey-Nagel, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente se realizó la amplificación por PCR para la secuenciación parcial de com.cytb El gen del parásito Haemosporidium y los procedimientos de secuenciación se realizaron como se describió anteriormente.²³. Genomas mitocondriales circulares policromophilus Los parásitos se amplificaron mediante PCR anidada inversa utilizando la polimerasa Takara LA Taq (Takara Mirus Bio Inc., Japón), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores se diseñaron basándose en com.cytb Secuencias policromophilus Fue obtenido en un estudio previo de los autores.²³. La PCR primaria se realizó utilizando los cebadores PolycMtCytOF (CTTACATTTACAAGGTAGCACTAATCCTTTAGG) y PolycMtCytOR (GTTGGGTCACTTACAAGATATCCACC). Las condiciones del ciclo de PCR incluyeron desnaturalización inicial a 94°C durante 1 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 s, hibridación a 54°C durante 30 s y extensión a 67°C durante 7 min. A esto le siguió una extensión final a 72°C durante 10 minutos. Se utilizaron tres microlitros del producto de PCR primario como plantilla para una reacción de PCR anidada utilizando los cebadores PolycMtCytIF (GCTACTCCATTACATATAGTTCCAGAATGG) y PolycMtCytIR (CACCGCATATCCATGATACAAGACC). Las condiciones del ciclo de PCR para la PCR anidada fueron idénticas a las de la PCR primaria. Se purificaron al menos dos productos amplificados independientes, de aproximadamente 6 kb de tamaño, utilizando el mini kit NucleoSpin Gel y PCR Clean-up (Macherey-Nagel, Alemania) y se clonaron en el vector fácil pGEM-T (Promega, EE. UU.). Para cada producto, se secuenciaron al menos cuatro clones. Se utilizó la plataforma de secuenciación de extremos emparejados de Illumina, utilizando la química de grupos del kit de reactivos MiSeq v2 y celdas de flujo con una longitud de lectura de 2 × 25 pb (Illumina, EE. UU.). Los procedimientos de secuenciación de Illumina fueron realizados por U2Bio, una organización con sede en Corea del Sur (https://www.u2bio.com). amplificación parcial clpc La transgénesis se realizó utilizando los cebadores específicos clpc-F (GGTAAAACTGAATTAGCAAAAATATTA) y clpc-R (GGACGAGCCTCCATATAAAGGAT), como lo describen Martinsen et al.⁷. Las condiciones de ciclado de la PCR incluyeron un paso de desnaturalización inicial a 94°C durante 4 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 20 s, hibridación a 50°C durante 20 s y extensión a 68°C durante 1 min. El paso de extensión final se realizó a 68 °C durante 7 min. A continuación, se extrajeron productos de PCR de 674 pb del gel de agarosa y se purificaron utilizando el mini kit NucleoSpin Gel y PCR Clean-up en preparación para la secuenciación de ADN de Sanger.

Anotación de secuenciación y visualización de genomas mitocondriales.

Completar la secuencia de todo el genoma mitocondrial pasa por integrar lo obtenido previamente com.cytb Secuencias, que posteriormente fueron anotadas y analizadas en comparación con secuencias de referencia de varios parásitos hemosporidiales, incluidos P. bubalis (LC090213) y P. Capray (LC090215). El proceso de anotación utilizó herramientas como el buscador NCBI ORF (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) y el servidor web MITOS. Para validar las secuencias obtenidas, los autores de este estudio realizaron búsquedas BLASTN en la base de datos GenBank, un repositorio completo y ampliamente reconocido de información genética disponible en línea en https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Alinear el policromophilus Las secuencias del genoma mitocondrial obtenidas en este estudio se realizaron utilizando MUSCLE v3.8.425 y se compararon con secuencias de P. falciparum Y P. galenacum (M76611 y AB250690). La identificación de genes, incluidos los fragmentados SSU rRNA y LSU rRNA, se basó en la anotación de P. falciparum Secuencia del genoma mitocondrial³⁵. Los mapas del genoma resultantes se visualizaron utilizando SnapGene® Viewer 6.0.6. Además, el contenido de GC y la inclinación de GC se determinaron utilizando una herramienta en línea (https://proksee.ca/projects/new).

Diferencias evolutivas por pares y análisis filogenéticos.

Se estimaron diferencias evolutivas por pares entre policromophilus filogenias en murciélagos utilizando genomas mitocondriales, aplicando el método Nei-Gojobori con corrección de Jukes-Cantor implementado en MEGAhttps://www.megasoftware.net/). En este estudio se secuenció el genoma mitocondrial. policromophilus sp. , con una longitud de 5994 a 6001 pb (como se enumera en la Tabla 1) y alineados con secuencias de la base de datos GenBank (Tabla S4). El conjunto de datos final, que consta de 95 secuencias de hemosporidios y 6227 pb, incluidos los espacios, se sometió a análisis filogenético. Método de máxima verosimilitud (ML) con IQ-TREE³⁶ Se utilizó para construir árboles filogenéticos, utilizando el mejor modelo identificado mediante aproximación de arranque ultrarrápido (UFBoot) con 1000 réplicas. El análisis de inferencia bayesiana (BI) se realizó utilizando MrBayes 3.2.7a a través de CIPRES Science Gateway (https://www.phylo.org/). Para el análisis de BI se utilizó el modelo de inversión de tiempo general (GTR) + I + G, elegido según el Criterio de información de Akaike (AIC) en ModelTest 2.1.4. Además, el árbol filogenético de policromophilus Fue construido utilizando secuencias mitocondriales completas concatenadas y clpc El gen del apicoplasto (como se enumera en la Tabla S5 y los datos obtenidos en este estudio; OP380887-90, OP380899-909). Este análisis incluyó policromophilus Secuencias de murciélagos en Tailandia, Camboya, Japón, Suiza, Madagascar, Kenia, Gabón y Guinea. Se analizaron un total de 43 secuencias y 6604 pb, incluidos los espacios, utilizando métodos ML y BI, como se describió anteriormente. Los árboles filogenéticos se visualizaron utilizando FigTree v1.4.4. Se utilizaron árboles de consenso de ML para todas las inferencias filogenéticas en este estudio.

Estimar la diferencia horaria policromophilus

Un total de 88 secuencias de nucleótidos para todo el genoma mitocondrial. policromophilus (Dos secuencias de este estudio: números de acceso OP380900 y OP380906) y otros hemoparásitos (86 secuencias como se enumeran en la Tabla S4), incluidos Plasmodio, Inflamación de la palanca, Nykteria, hemoproteico, HemodiálisisY Leucocito Los géneros se alinearon utilizando MUSCLE v3.7 a través del Portal Científico CIPRES. Todas las secuencias de nucleótidos se alinearon y recortaron, dejando una longitud total de 6123 pb, incluidos los espacios, y posteriormente se importaron a BEAUti v2.7.5.³⁷ Como entrada para el estado evolutivo y los cálculos de tasas. El modelo de sustitución de nucleótidos más apropiado (modelo de sitio) se seleccionó utilizando la prueba del modelo BEAST.³⁸ Disponible en BEAUti v2.7.5 Luego se estimó la tasa de evolución utilizando un modelo normal de historial de reloj rápido. Mientras tanto, el modelo navideño fue elegido como árbol previo para especies y fechas a nivel de especie, como lo sugieren Suchard et al.³⁹.

Para estimar los tiempos de divergencia para policromophilus clado, este estudio incluyó cuatro puntos de calibración en el análisis. Los dos primeros puntos de calibración se basaron en edades de huéspedes vertebrados fósiles obtenidos de fuentes disponibles públicamente como TimeTree of Life (http://www.timetree.org) y base de datos de paleobiología (https://paleobiodb.org). El primer punto de calibración indicó que la divergencia entre los parásitos de la malaria encontrados en los monos africanos del Viejo Mundo (números de acceso AB434918 y AY800112) y los encontrados en los monos asiáticos del Viejo Mundo ocurrió hace aproximadamente entre 6 y 14,2 millones de años (Mya).^40,41. Asimismo, el segundo punto de calibración indicó que el origen de los parásitos de la malaria en Indriidae (números de acceso OL999500 y HQ712057) y Lemuridae (números de acceso OL999498 y HQ712054) se remonta a un rango de hace 20 a 42 millones de años.^20,42,43. Además, los dos últimos puntos de calibración se establecieron en base a análisis de datación molecular. La diferencia entre la malaria humana. paludismo (Número de acceso AB354570) y la parasitemia por malaria en monos macacos puede haber ocurrido hace entre 23,5 y 34 millones de años, según lo investigado por Pacheco et al.²⁰. Asimismo, se encontró que los parásitos de la malaria originados en ungulados (Bovidae-Muscidae-Syrphiidae) divergieron hace entre 20,8 y 26,6 millones de años, lo que es consistente con el origen de sus huéspedes.⁴⁴. Para estimar los tiempos de divergencia en función de los puntos de calibración y las configuraciones mencionadas anteriormente (consulte el archivo XML complementario), se implementó el método predeterminado en el paquete BEAST v2.7.3.³⁷ Reclutados a través del Portal Científico de CIPRES. El análisis implicó ejecutar 100.000.000 de generaciones de MCMC y tomar muestras cada 10.000 generaciones. La convergencia de la cadena de Markov y los tamaños de muestra estimados (ESS) se evaluaron utilizando Tracer v1.7.1⁴⁵. El primer 10% de las generaciones de MCMC se descartaron como burn-in y se generó un árbol de credibilidad de rama máxima utilizando TreeAnnotator v2.7.5. Finalmente, un árbol de tiempo que representa la divergencia estimada de policromophilus Otras interfaces sangre-parásitos se visualizaron utilizando FigTree v1.4.4.

Declaración ética y permisos.

Las muestras de este estudio se recolectaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Chulalongkorn (IBC No. 2031032) y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de las regulaciones y políticas de la universidad que rigen el cuidado y uso. de animales de laboratorio. (IACUC N° 1931090). Los murciélagos fueron capturados bajo permisos emitidos por el Departamento de Parques Nacionales, Vida Silvestre y Conservación de Plantas de Tailandia (DNP 0909.6/22928 y DNP 0907.4/29038). Este estudio se ha informado de acuerdo con las directrices ARRIVE (https://arriveguidelines.org).