El estudio concluyó que el virus de la viruela símica se detectó fácilmente mediante qPCR utilizando tres ensayos clínicamente validados.

En un estudio reciente publicado en medRxiv*, los autores validaron ensayos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa para el virus de la viruela símica (MPXV).

estancia: Evaluación y validación clínica de ensayos de PCR del virus de la viruela del simio en tiempo real. Crédito de la imagen: Oscar Martínez Troncoso/Shutterstock

antecedentes

Los casos de viruela del simio humano (MPX) rara vez se han detectado fuera de los países endémicos con MPXV desde su descubrimiento en la década de 1970. Esta enfermedad zoonótica se descuidó hasta el brote en curso, a pesar de las advertencias de propagación global y la evidencia de una mayor transmisión de persona a persona. Se han notificado más de 77 000 casos de MPX en más de 100 países en el brote de MPX en curso.

Los casos de MPX pueden presentarse con fiebre, linfadenopatía y erupción papilar. Las personas inmunocomprometidas corren el riesgo de sufrir manifestaciones graves de MPX, incluida la muerte. El fármaco antiviral tecovirimat (Tpoxx) y la vacuna JYNNEOS desarrollada originalmente para la viruela son las dos únicas contramedidas contra la MPX. Dado que la detección temprana y rápida del virus es esencial para la prevención y el tratamiento de MPX, el desarrollo de ensayos de qPCR es vital para interrumpir las redes de transmisión.

Estudio y resultados

En este estudio, los autores evaluaron dos ensayos de qPCR para MPXV dirigidos a los loci G2R y F3L y compararon su sensibilidad, especificidad y precisión con el ensayo de pan-ortopoxvirus (OPXV-E9L) en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC). Los autores obtuvieron comercialmente ADN MPXV sintético (VR-3270SD) debido a la escasez de muestras clínicas MPXV y ADN genómico en la primavera de 2022.

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El modelo adquirido (VR-3270SD) contiene sitios de unión para cebadores y sondas para varios ensayos desarrollados previamente. Los autores estimaron que el número exacto de copias de este estándar mediante PCR de gotitas digitales (ddPCR) es de 1,29 x 10.8 copias/ml de sitios MPXV-F3L y OPXV-E9L, 1,3 × 108 Copia/ml locus para MPXV-G2R.

Los autores analizaron 15 muestras positivas para el virus del herpes simple (VHS), 17 muestras positivas para el virus de la varicela zoster (VVZ) y 52 muestras de frotis de piel negativas para VHS/VVZ mediante la prueba OPXV-E9L y verificaron que eran negativas para MPXV. El ensayo de ADN F3L no detectó MPXV en estas muestras, mientras que en el ensayo G2R una muestra positiva para VZV dio positivo para G2R pero dio negativo para G2R tras la replicación.

Los ensayos G2R y F3L tuvieron una concordancia negativa del 98,8 % y el 100 %, respectivamente, en 84 muestras. A continuación, el equipo probó la reactividad cruzada de los ensayos MPXV con viruela vacuna (CMLV), viruela vacuna (CPXV) y vaccinia (VACV), que son parientes cercanos de los virus MPXV. Los ensayos MPXV-F3L y -G2R no detectaron ADN de CMLV, CPXV y VACV, mientras que el ensayo OPXV-E9L mostró valores medios de umbral de ciclo (Ct) de 19,8, 25,8 y 23,8, respectivamente.

La capacidad para detectar el ADN de MPXV se evaluó utilizando positivos artificiales. La tasa de concordancia positiva fue del 100 % para el ensayo OPXV-E9L y del 99,1 % para los ensayos MPXV-G2R y -F3L. Además, probaron si los ensayos G2R y F3L detectarían con precisión MPXV en muestras (clínicas) y obtuvieron siete muestras de frotis de piel positivas para MPXV de un laboratorio de salud pública (PHL).

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Las muestras de PHL se diluyeron 1:40 antes de la extracción debido a limitaciones de tamaño. Se analizaron veinte muestras clínicas positivas para MPXV en el ensayo F3L junto con los ensayos OPXV-E9L y MPXV-G2R. Los ensayos para MPXV tenían, en promedio, valores de Ct más bajos que el ensayo OPXV-E9L para cada muestra. Además, el ensayo G2R tuvo un Ct más bajo que el ensayo F3L en cada muestra, de acuerdo con dos copias del G2R en el genoma MPXV.

Los autores estimaron que el límite de detección (LoD) es de 330 copias/ml, lo que equivale a 3,3 copias por reacción (PCR) utilizando métodos de extracción estándar para los ensayos MPXV-F3L y -G2R. También validaron el ensayo MPXV-F3L utilizando diferentes tipos de muestras, como líquido cefalorraquídeo, orina, suero, plasma, sangre completa e hisopos orales/rectales/nasofaríngeos/vaginales.

El porcentaje de acuerdo negativo fue del 100 % para todos los tipos de muestras. La concordancia porcentual positiva fue del 100 % para hisopos nasofaríngeos/rectales/vaginales, plasma, líquido cefalorraquídeo, sangre entera y leche materna, 95,7 % para muestras de orina y 95,5 % para muestras de suero. El límite para estas muestras se estimó en 1000 copias/mL (10 copias/mL por reacción).

Utilizando muestras clínicas MPXV, la tasa de aprobación negativa fue del 100 % para saliva, semen e hisopos anales/orales/secos. La tasa de concordancia positiva fue del 100 % para saliva, hisopos rectales y semen y del 95 % para hisopos orales/secos. El LoD para el ensayo F3L fue de 260 copias/mL para semen, 780 copias/mL para saliva, hisopos orales y anales, y 810 copias/mL para hisopos secos.

conclusiones

En resumen, el estudio actual evaluó la sensibilidad y la especificidad de los conjuntos de sondas y cebadores específicos de MPXV junto con un ensayo de virus de ortopox. El LoD para estos ensayos fue tan bajo como 3,3 copias por reacción (PCR) por extracción de hasta 250 μl de muestra. Ninguno de los ensayos mostró reactividad cruzada con VZV o HSV, lo que indica una alta especificidad.

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En general, el rendimiento de los tres ensayos para detectar MPXV fue similar, siendo cada uno muy sensible al ADN de MPXV. El ensayo MPXV-F3L tiene una alta especificidad para MPXV y no ha interactuado con HSV u otros ortopoxvirus y será una herramienta importante para reducir la transmisión de MPXV en un brote en curso.

*Nota IMPORTANTE

medRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, dirigir la práctica clínica o el comportamiento relacionado con la salud, ni tratarse como información sólida.

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