La nueva plataforma FREM proporciona hasta un 98% de precisión para una detección y genotipado rápidos

En un estudio reciente publicado en Biomedicinalos investigadores han desarrollado una plataforma de microfluidos (FREM) flexible, robusta y sin equipos para la detección de malaria y el genotipado de especies de Plasmodium.

Estancia: Una plataforma de microfluidos versátil para la detección de infecciones por malaria y el genotipado de especies de Plasmodium. Fuente de la imagen: nechaevkon/Shutterstock.com

fondo

La malaria, un problema de salud mundial causado por especies de Plasmodium, necesita una cuidadosa detección y genotipificación para un control eficaz. La principal técnica de diagnóstico es la prueba de amplificación de ácidos nucleicos. Sin embargo, su despliegue generalizado plantea obstáculos en entornos con recursos limitados.

Los sistemas CRISPR/Cas han transformado el diagnóstico molecular, pero a menudo requieren dos etapas independientes, lo que complica los procedimientos e impide su implementación universal.

El uso de sistemas limitados plantea dificultades de biocompatibilidad y la posibilidad de reducir la eficiencia de detección. La tipificación genética precisa es crucial para el tratamiento y los esfuerzos de control de la malaria.

Sobre el estudio

En este estudio, los investigadores evaluaron la eficacia de una plataforma de microfluidos para la detección simultánea de malaria y Plasmodio Genotipado.

Para realizar pruebas de infección por malaria y Plasmodio Al realizar la genotipificación, la plataforma de microfluidos ha combinado la amplificación de la polimerasa recombinante (RPA) con la detección basada en repeticiones palindrómicas cortas regularmente espaciadas (CRISPR).

Los investigadores crearon filtros de ARN CRISPR (crRNA) universales y específicos de cada especie para cinco personas Plasmodio especies, cada una con un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) para reconocer Cas12a. Se recogieron muestras de sangre de todos los sujetos y los reactivos de RPA se mezclaron con sacarosa en un tubo antes de administrarlos a las máquinas CRISPR.

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Se ha utilizado un ARNcr dirigido a secuencias conservadas de Plasmodium para probar la infección por malaria. En cada experimento mediado por Cas12a, cinco ARN CRISPR se dirigen a loci distintos Plasmodium falciparum, Paludismo por Plasmodium, Plasmodium oval, Plasmodium vivaxY Plasmodium conocimiento usado. Para realizar el diagnóstico de malaria se utilizó un sistema de microfluidos capaz de evaluar seis objetivos en conjunto.

Se creó un chip de microfluidos que medía 7,2 mm (alto) x 26 mm (diámetro) utilizando una impresora 3D para lograr la detección multiplexada. Los sistemas Cas12a (n = 6) se alojaron en sus respectivas cámaras, cada una de las cuales contenía ARN CRISPR distintos para Plasmodio Y otros tipos.

Se inyectaron noventa litros de solución de amplificación de polimerasa recombinante en el puerto de entrada central y se distribuyeron uniformemente a las cámaras periféricas a través de tubos capilares.

La actividad de escisión de Cas12a se desencadena tras el reconocimiento específico del ARN CRISPR para volver a ensamblar amplificadores de polimerasa, dando una señal fluorescente o colorimétrica para diferenciar los casos positivos de malaria.

Se tomaron imágenes del chip de microfluidos utilizando cámaras de teléfonos inteligentes después de la exposición a una luz azul de diodo emisor de luz (LED).

Los ácidos nucleicos utilizados en los ensayos FREM se utilizaron en PCR y se secuenciaron para su detección y clasificación. Plasmodio Especies en muestras clínicas de DBS. Se utilizó electroforesis en gel a base de agarosa al dos por ciento para evaluar los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

resultados

Múltiples tipos de Plasmodio Se detectaron utilizando un chip de microfluidos, se amplificaron utilizando cebadores de amplificación de polimerasa recombinante universales y se genotiparon utilizando ARNcr específicos. La combinación de RPA y CRISPR permite una identificación eficaz de los ácidos nucleicos diana.

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La solución de sacarosa separó los ensayos CRISPR y RPA en un solo recipiente, aliviando los problemas de compatibilidad.

Los investigadores llevaron a cabo el experimento en un solo recipiente con y sin solución de sacarosa y compararon la eficiencia evaluando la intensidad de la señal fluorescente en el punto final y en tiempo real.

La reacción en un solo recipiente con cebadores superiores a 400 nM alcanzó una meseta después de 60 minutos, con una variación mínima en el rendimiento de detección entre 38–42 °C y 38 °C, que se identificó como la temperatura de funcionamiento óptima para FREM.

La sensibilidad de detección de la reacción de un solo recipiente (102 copias/L) fue 10 veces menor que la del enfoque de dos pasos. El límite de detección del portaobjetos (LOD) fue equivalente a leer la señal fluorescente del tubo.

El análisis de alineación de secuencias múltiples (MSA) reveló que los sitios objetivo se conservaban entre las especies de Plasmodium. El dispositivo de microfluidos produjo una estratificación eficiente y mejoró la flexibilidad de la plataforma.

La evaluación clínica de extractos de ácido desoxirribonucleico de individuos sospechosos de malaria reveló que la plataforma de microfluidos tenía mayor sensibilidad (98%) y especificidad (93%), arrojando resultados similares con la secuenciación por PCR para el diagnóstico de malaria.

Valores de concordancia demostrados del 91% entre la plataforma de microfluidos y la secuenciación por PCR Plasmodio Precisión del genotipado. Los investigadores han descubierto un conjunto de cebadores de amplificación de polimerasa recombinante con la mejor eficacia para amplificar un fragmento de gen conservado de cinco especies.

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La concordancia general para la detección de infección por malaria utilizando la plataforma de microfluidos alcanzó el 99 % (153/154), combinando los resultados de la secuenciación de PCR y QPCR.

Ramificaciones

Según los resultados del estudio, la plataforma de microfluidos es una posible opción general Plasmodio Detección de infecciones y genotipado de especies para mejorar el control de la malaria y ampliar su uso a otras infecciones.

Utiliza una solución de sacarosa al 10 % y combina pruebas RPA y CRISPR en un dispositivo de un solo recipiente, lo que simplifica el procedimiento de diagnóstico y garantiza una alta eficiencia.

Este método es particularmente útil para detectar cinco Plasmodio especies, mejorar la vigilancia epidemiológica, influir en las decisiones de tratamiento y transformar la prestación de atención sanitaria. La plataforma se alinea con el objetivo más amplio de eliminar la malaria para 2040.

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