Las imágenes Raman ofrecen un mayor potencial para detectar múltiples actividades enzimáticas que las imágenes de fluorescencia, como lo demuestran los investigadores de Tokyo Tech al desarrollar sondas Raman activables basadas en 9CN-rhodol utilizando un mecanismo novedoso para activar la señal Raman. La estrategia permite la síntesis de sondas Raman altamente activadas con alta capacidad de agregación y multiplexación, lo que la convierte en una herramienta prometedora para extender las sondas Raman para detectar múltiples actividades enzimáticas en tejidos biológicos heterogéneos.
La participación de las enzimas en una amplia gama de actividades biológicas las convierte en biomarcadores ideales para la detección de enfermedades. De hecho, las técnicas de diagnóstico para el cáncer utilizan imágenes de fluorescencia para detectar enzimas reguladas al alza asociadas con el cáncer en las células afectadas. Además, debido a que el tejido tumoral es heterogéneo, la detección simultánea de múltiples actividades enzimáticas puede permitir una visualización y un diagnóstico precisos del cáncer. Sin embargo, la incapacidad de detectar múltiples actividades enzimáticas puede limitar la aplicación de imágenes de fluorescencia en tejidos tumorales heterogéneos y otros fenómenos biológicos complejos.
Como alternativa, el estrecho ancho espectral de las imágenes de espectroscopia Raman ofrece la esperanza de multiplicar las imágenes biológicas utilizando sondas moleculares. A lo largo de los años, se han desarrollado muchas sondas (colorantes) Raman funcionales y procesables para detectar bioanalitos, pero las que detectan actividades enzimáticas han sido limitadas. Además, las estrategias de diseño anteriores no lograron controlar la difusión del producto de hidrólisis inducida por enzimas para estas sondas, lo que dificulta la distinción de regiones con actividad enzimática diana en los tejidos.
En este contexto, un equipo de investigadores de Japón dirigido por el profesor Mako Kamiya y el profesor asociado Hiroyoshi Fujioka del Instituto de Tecnología de Tokio (Tokyo Tech) informó recientemente, inspirándose en sondas fluorescentes basadas en ensamblaje, una nueva estrategia de diseño molecular para la síntesis de sondas accionables Raman basadas en 9CN-rhodol. Sus estudios fueron Publicado en el Diario de la Sociedad Química Americana.
Al explicar la selección de derivados de rodol para el andamiaje molecular, el profesor Kamiya explica: «Hiroyoshi descubrió que los derivados de rodol con un grupo nitrilo en la novena posición (9CN-rodoles) y una carga neta de cero exhiben un solo pico Raman nítido y el poder de recolección más alto en una solución acuosa de 9CN-pironeno cargado positivamente. En consecuencia, utilizamos colorantes de andamiaje 9CN-rhodol para crear sondas Raman que pueden exhibir una alta sensibilidad y sufrir un cambio hacia el rojo en la absorción molecular hacia la región resonante del efecto Raman y la agregación de forma tras la interacción con el objetivo enzimas
En consecuencia, el equipo primero sintetizó derivados de 9CN-rhodol y seleccionó dos derivados, 9CN-JR y 9CN-JCR, como candidatos para el diseño de sondas Raman activables. Luego probaron el rendimiento de detección de enzimas de ambas sondas en células vivas utilizando la técnica de imagen de dispersión Raman de dos colores estimulada (SRS). De las dos, la 9CN-JCR surgió como la mejor y más brillante sonda multiplex.
A continuación, el equipo etiquetó el grupo nitrilo del andamio 9CN-JCR con carbono 13 (13c) y nitrógeno 15 (15N) luego generó dos sondas de isótopos 9CN-JCR para las enzimas γ-glutamil transpeptidasa y dipeptidil peptidasa-4. El nuevo conjunto de sondas basado en el 9CN-JCR pudo detectar simultáneamente las actividades de todas estas enzimas en cultivos de células vivas.
Además, las sondas permitieron obtener imágenes ex vivo de distintas regiones celulares que expresan la actividad enzimática diana en el disco alar y el cuerpo graso de Drosophila. La alta selectividad y sensibilidad espacial demostrada por las sondas 9CN-JCR se atribuye al efecto de resonancia preelectrónica del tinte de andamio y la formación general de productos de hidrólisis formados a partir de la interacción sonda-célula objetivo.
Las sondas basadas en Rhodol pueden agregarse tras la interacción con enzimas, mejorando su retención intracelular y aumentando la intensidad de la señal SRS durante la detección de enzimas.
En resumen, la estrategia sencilla descrita en este estudio puede facilitar el desarrollo de sondas Raman actinizables altamente específicas para la detección simultánea de múltiples actividades enzimáticas. «Nuestra estrategia para el diseño molecular basado en ensamblaje de sondas Raman proporcionará ventajas significativas para aplicaciones que impliquen la monetización de la actividad enzimática asociada con enfermedades y actividades biológicas básicas», concluye el profesor Kamiya.
Este proyecto se llevó a cabo en colaboración con el profesor Yasuyuki Ozeki de la Universidad de Tokio.
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