Nueve pacientes con convulsiones neonatales vinculadas a KCNQ2 y estudios funcionales de dos variantes missense

Pacientes y recogida de datos clínicos

La Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chulalongkorn aprobó este estudio (IRB No. 264/62) siguiendo las Directrices de la Declaración de Helsinki y todas las enmiendas posteriores. Se obtuvieron consentimientos informados por escrito de los padres o tutores legales de los participantes. Desde junio de 2016 hasta diciembre de 2020, estudiamos a 104 pacientes con epilepsia infantil resistente a los medicamentos, definida como el fracaso de los ensayos apropiados de dos medicamentos antiepilépticos.²⁰ que se sometió a la secuenciación del exoma o del genoma en el King Chulalongkorn Memorial Hospital. El grupo se describe en el trabajo anterior de los autores.²¹. Se encontró que nueve pacientes albergaban patógenos o variantes causantes de enfermedades en KCNQ2 gene. Se recogieron datos demográficos detallados y características clínicas. Diagnóstico de epilepsia neonatal benigna/autolimitada (OMIM #121200) o KCNQ2– Las encefalopatías del desarrollo y la epilepsia (DEE; OMIM #613720) se realizaron con base en la clasificación ILAE y la definición de síndromes epilépticos con inicio neonatal e infantil^{22, 22}.

Exoma, secuenciación del genoma, bioinformática y priorización de variantes

Se realizó el trío exoma o genoma para las nueve familias. El ADN genómico se aisló de leucocitos de sangre periférica. Para la secuenciación del exoma, el ADN se enriqueció con los kits SureSelect Human All Exon V5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se envió a Macrogen Inc. , Seúl, Corea del Sur. Se utilizó un secuenciador Illumina HiSeq 2000 con una salida objetivo de 6 Gb. Para la secuenciación del genoma, el ADN se envió al Instituto del Genoma de Beijing (BGI), China. Las lecturas de secuencia en los archivos de secuencia FASTQ se alinearon con el genoma de referencia humano hg19 de UCSC utilizando el software Burrows-Wheeler Alignment (BWA) (http://bio-bwa.sourceforge.net/). Las variantes de un solo nucleótido (SNV) y las pequeñas inserciones/deleciones (indels) fueron detectadas por GATK Haplotypecaller y anotadas por dbSNP&1000G.

Lista de 728 genes asociados con el síndrome de epilepsia según Genomics England PanelApp versión 2.2 (https://nhsgms-panelapp.genomicsengland.co.uk/panels/402/v2.2) para el primer paso del análisis. El análisis incluyó una lista de genes fuera de las ‘entidades verdes’ con altos niveles de evidencia de asociación con la enfermedad. Análisis in silico incluyendo SIFT (http://sift.jcvi.org/); polivin-2, (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/); M-CAP (http://bejerano.stanford.edu/mcap/); CAD (https://cadd.gs.washington.edu/); El umbral de patogenicidad recomendado >20) también se utilizó para predecir la patogenicidad de las variantes. Las variantes se consideraron nuevas si no se informaron previamente en la base de datos de ensamblaje del genoma (gnomAD V3.1.2; https://gnomad.broadinstitute.org/), clinvar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/), no documentado en la literatura científica de PubMed, y no identificado en la base de datos interna de exomas de referencia tailandesa (T-REx)²³. Las variantes se clasificaron según la recomendación del American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG).²⁴.

Construcción de plásmidos, expresión de proteínas y localización en células HEK293

pcDNA3.1 + /KV7.2-DYK (n.º NM_004518.6) y pcDNA3.1 + /KV7.3-DYK (n.º NM_004519.4) fueron sintetizados por Genscript (Piscataway, NJ, EE. UU.). cDNAKv7.2 se clonó en el vector pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.), lo que resultó en una GFP C-terminal, que se usó para seleccionar las células transfectadas. Las dos nuevas mutaciones, c.774C>G p. (N258K) y c.836G>A p. (G279D), utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los cebadores mutagénicos se enumeran en la Tabla complementaria S1. Todos los plásmidos se verificaron mediante secuenciación de Sanger.

Las células HEK 293 se transfectaron transitoriamente con 2,5 μg ml de tipo salvaje, p. (N258K), o pág. (G279D) Kv7.2 para experimentos de homogeneización homeostática utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen). Para los experimentos heterocigóticos, se cotransfectaron diferentes cepas Kv7.2 con Kv7.3 de tipo salvaje (Kv7.2/Kv7.3 de tipo salvaje, p(N258K) Kv7.2/Kv7.3, p(G279D) Kv7 .2 /Kv7.3, tipo salvaje Kv7.2/p.(N258K) Kv7.2/Kv7.3, tipo salvaje Kv7.2/p.(G279D) Kv7.2/Kv7.3) en una proporción de 1 :1 (1,25 g:1,25 g) o una relación 1:1:2 (0,625 g:0,625 g:1,25 g) y ensayo 48 o 72 horas después de la transfección.

Se usó análisis de transferencia Western para determinar las expresiones de Kv7.2 en células HEK293 transfectadas. Las células se rasparon, centrifugaron y resuspendieron. La proteína de membrana y la proteína citoplasmática se extrajeron utilizando el kit de extracción de proteínas de membrana Mem-PER Plus (Thermo Fisher). La proteína de membrana y la proteína citoplasmática se separaron sobre la base de su hidrofobicidad usando dos adaptadores diferentes, tampón de permeabilidad y tampón de solubilización. Luego, 20 μg de proteínas desnaturalizadas se separaron en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 8% y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Invitrogen). Las membranas transfectadas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) en leche descremada en polvo al 5 % y se incubaron durante la noche a 4 °C con un mAb de conejo monoclonal anti-Kv7.2 (1:500) (Danvers Cell Signaling, MA, USA) en albúmina de suero bovino (BSA) al 5% y luego con monoclonalGAPDH de conejo (1:500) (señalización celular) en BSA al 5 % como control de carga. A continuación, las membranas se incubaron durante 2 ha temperatura ambiente con IgG anti-conejo, anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:1.000) (señal celular) en BSA al 5%. Las bandas de proteínas específicas se visualizaron utilizando la imagen química ImageQuant Las4000 (GE Healthcare).

Para la inmunofluorescencia, las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 15 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % durante 20 min (canales heterólogos) y luego se bloquearon con BSA al 1 % durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se sembraron durante la noche a 4 °C con anti-KCNQ3 policlonal (1:800) (Invitrogen #PA1-930) en un 0,1 % del área de la superficie corporal y luego se incubaron con Donkey anti-Rabbit IgG H&L (1:500) (Alexa) . Fluor 647, abcam) en BSA al 0,1 % durante 2 h a temperatura ambiente y montado con ProLong Gold Antifade Mountant (Invitrogen n.º P36934). Las imágenes confocales se obtuvieron utilizando un microscopio Zeiss Axio Monitor z1 equipado con una lente de inmersión en aceite de 63x. Se utilizó el software Zen 3.4 (versión azul) para el análisis de imágenes.

Adquisición y análisis de datos electrofisiológicos y de potasio (K+)

A las 48 h después de la infección, las células se clasificaron utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y se sembraron en placas de petri de 35 mm de poli-D-lisina (2 mg/ml) recubiertas previamente. Las corrientes de potasio se verificaron mediante la técnica estándar de pinzamiento de parche de células completas, utilizando un amplificador Axopatch 200-B (Axon Instruments, Inc, Melbourne, Australia), controlado por un transductor digital Digidata 1440A. Se utilizó el software pCLAMP (versión 10, Axon Instruments, Inc) para la adquisición y el análisis de datos. La solución extracelular contiene (en mM) lo siguiente: 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl2, 10 glucosa, 10 HEPES, pH 7,3–7,4 titulado con NaOH; La osmolaridad es de 315-320 mOsm/kg. Los microelectrodos (capilares de vidrio de borosilicato BF150-86-10, Sutter/EE. UU.) tienen una resistencia de 1 a 3 MΩ cuando se extraen con una solución intracelular que contiene (en mM) lo siguiente: 140 K-gluconato, 2 MgCl₂1 carcajada_2, 10 EGTA, 10 HEPES y 10 Mg ATP, pH 7,3–7,4 titulado con KOH; La osmolaridad es de 285-290 mOsm/kg. Las células se mantuvieron a -80 mV, los pasos de voltaje de 10 mV en 1,3 s desde -110 mV a +50 mV y las contracorrientes se registraron a un voltaje de -40 mV.

Las propiedades eléctricas se ilustraron mediante trazas de corriente M sin procesar representativas, las curvas de corriente-voltaje (IV) se usaron para estimar la conductividad y los potenciales de inversión, y la densidad de corriente M se usó para estimar la capacitancia eléctrica.^dieciséis. Se calculó como la corriente máxima (pA) a +50 mV dividida por la capacitancia de la celda (pF). Las propiedades de activación de K+ se investigaron mediante un voltaje de media activación (V_1/2) detectando la despolarización de los canales, y conectando la pendiente (k) de los canales. Calculado por la función de Boltzmann: I = 1/[1 + exp(V½–V)/k], V½ = voltaje semienergizado, k = pendiente, con una amplitud de corriente de cola de −40 mV. La resistencia de la membrana (Rm) se calculó según la ley de Ohm (V = IR), I es la corriente, V es el voltaje y R es la resistencia detectada La resistencia de la membrana celular cuando los iones fluyen a través de ella²¹. El tiempo de membrana es constante. (tao) Calculado por Rm Cm, Cm es la capacitancia de membrana detectada en el momento de cambiar el potencial de membrana²⁵.

análisis de los datos

Los datos se expresan como media ± SEM Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS y GraphPad Prism 9.4.0. Se usó ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey para determinar la diferencia estadística de las respuestas experimentales de las células transfectadas y no transfectadas, así como las respuestas entre el tipo salvaje y los mutantes. El número de muestras (n) se indica en las leyendas de las figuras. La significancia estadística fue determinada por *s0,05**s0,01 yen, ***s0,001 yen japonés.